Wyniki wyszukiwania - BazTech

1

Badania FTIR-ATR i fluorescencyjne układów białkowo-lipidowych

Litwińczuk-Mammadova A., Cieślik-Boczula K., Rospenk M.

Wiadomości Chemiczne

|

2017

|

[Z] 71, 1-2

109--132

EN

Lipid-protein systems paly curtail roles in living systems [49]. Hence, a determination of their structure at different levels of organization is still one of the most important tasks in many research projects. A study of lipid-protein systems is based on many physicochemical techniques, such as spectroscopy of FTIR, Raman, fluorescence, NMR, EPR, as well as DLS, DSC and TEM methods. In the presented paper tow of the most frequently used methods, that is FTIR and fluorescence spectroscopy, will be discussed in details. They are characterized by a relatively low cost of sample preparation, a short measuring time, and they give a huge number of structural and physicochemical information about lipid-protein systems. In the FTIR-ATR spectroscopy many of vibrational bands are commonly used as very precise vibrational indicators of structural changes in lipids and proteins (Fig. 1) [1–6]. They allows to characterize lipid and protein components separately in mixed systems. Additionally, structural changes in lipid membranes can be monitored in one FTIR-ATR experiment simultaneously in a region of hydrophilic lipid head-groups (Fig. 5) [17, 18], in a hydrophobic part composed of hydrocarbon lipid chains (see Figures 2 and 3) [7–9], and in a lipid membrane interface represented by ester lipid groups (Fig. 4) [4, 6, 11, 12]. A secondary structure of proteins and peptides in different experimental conditions can be defined in the FTIR-ATR spectroscopy on the base of amide I bands (Fig. 6 and Tabs 1, 2 and 3) [20–22]. A fluorescence spectroscopy is a complementary methods to FTIR spectroscopy in a study of lipid-protein systems. It competes information about time-dependent and very fast (in a scale of femtoseconds) structural processes in both lipids [41–45] and proteins [23, 27, 48]. The folding, denaturation, and aggregation of proteins and lipid membranes accompanied by changes in an order, packing and hydration of the system under study [23, 27, 41–45, 48].

2

The study of phenylboronic acid optical properties towards creation of a glucose sensor

Kur-Kowalska K., Przybyt M., Miller E.

Biotechnology and Food Science

|

2014

|

Vol. 78, nr 2

101--110

EN

The article presents influence of pH and glucose concentration on phenylboronic acid (PBA) fluorescence studied by steady-state and time-resolved measurements. Fluorescence of PBA decreases with growing pH. These changes reflected acid-base equilibrium of PBA and allowed to estimate value of pKd as 9.2, which is comparable with literature data. Fluorescence intensity of phenylboronic acid is quenched in presence of glucose. The effect of quenching is more pronounced with increasing pH. At pH 7 quenching can be described by Stern-Volmer equation, at pH 8 and 9 by modified one. The obtained quenching constants are growing with pH increase. The quenching of phenylboronic acid fluorescence by glucose is a static one, which is confirmed by time-resolved measurements. Two lifetimes were found for fluorescence decay of phenylboronic acid. The lifetimes are practically independent on pH and glucose concentration and also fraction of both lifetimes are nearly the same. The obtained Stern-Volmer constants can be interpreted as apparent equilibrium constants of ester formation between acid and glucose.

3

Experimental and theoretical investigation of drotaverine binding to bovine serum albumin

Gałęcki K, Courtade G, McFall A., Prieschl Teixeira R., Grgic M., Esteve-Sistere M., Maglemose Westphalen R., Kowalska-Baron A.

Biotechnology and Food Science

|

2013

|

Vol. 77, nr 1

25--36

EN

This study was motivated by the need to provide more insight into the possible mechanism of the intermolecular interactions between antispasmodic drug drotaverine and one of the serum albumins (BSA), with the aim to indicate the most probable sites of these interactions. For this purpose both experimental (spectrofluorometric titration at various temperatures) and theoretical (molecular mechanics) methods have been applied. The obtained results clearly showed that drotaverine quenched BSA fluorescence, and the most probable mechanism is static quenching. The negative value of the theoretically predicted binding free Gibbs energy (-23.8 kJ/mol) confirmed the existence of the intermolecular interactions involving drotaverine and one tryptophan within BSA protein and was well agreed with the experimentally determined value of -25.2 kJ/mol.

4

Fluorescence quenching study of tryptophan residues in fungal lipase from Rhizomucor miehei

Stobiecka A.

Zeszyty Naukowe. Chemia Spożywcza i Biotechnologia / Politechnika Łódzka

|

1998

|

Z. 60

53-63

EN

The iodide-quenching of a four-tryptophan-containing lipase from Rhizomucor miehei has been investigated The results of steady-state fluorescence quenching experiments at various excitation wavelengths have shown the presence of two classes of lipase emission. One of the component, exposed to solvent has an effective Stern-Volmer quenching constant equal to 8.00 ± 0.43 M-1 at λex = 290 nm and 11.90 ± 0.49 M-1 at λex = 300 nm, respectively. The second component was unquenchable by iodide. The fluorescence emission spectra of lipase have been separated into components using a modified Stern-Volmer equation. Obtained results demonstrated that the spectral shifts upon red-edge excitation have been observed only for accessible tryptophans. The fluorescence peak of exposed residues within protein when illuminated at the wavelength range from 290 nm to 300 nm was shifted from 344 ± 1 nm to 354 ± 1 nm. Contrary, the maximum of fluorescence emission of inaccessible tryptophans was equal to 338 ± 1 nm, irrespective to the excitation wavelength used.

PL

W niniejszym artykule przedstawione zostały wyniki wstępnych pomiarów fluorescencyjnych zewnątrzkomórkowej lipazy pleśniowej z Rhizomucor miehei (Rml). Metodami fluorescencji stacjonarnej badano wygaszanie emisji reszt tryptofanowych enzymu: Trp38, Trp55, Trp88 oraz Trp223 jonami P. Pomiary naturalnej fluorescencji lipazy Rml wykonywane były w buforowanym roztworze wodnym o pH 7.2 dla zakresu długości fal wzbudzenia: 290 - 300 nm. Wyniki badań wygaszania fluorescencji enzymu wskazują na obecność dwóch frakcji reszt tryptofanowych: wygaszalnej jonami I-, której udział w całkowitej fluorescencji Rml wzbudzanej przy λex = 295 nm wynosi 51% zaś stała Sterna-Volmera Ksv - 9.45 ± 0.9 M-1 oraz niewygaszalnej jonami I-, stanowiącej 49% całkowitej emisji białka lipazy. Analiza krzywych wygaszania zarejestrowanych w zakresie długości fal emisji: 320 - 380 nm pozwala na stwierdzenie, iż położenie maksimum fluorescencji wygaszalnej frakcji reszt tryptofanowych lipazy zależy od długości fali wzbudzenia i przypada na: 344, 348, 349 oraz 354 ± 1 nm odpowiednio dla λex = 290, 295, 297 oraz 300 nm. Podobnie, wraz ze zmianą długości fali wzbudzenia obserwuje się wzrost wartości stałej wygaszania dynamicznego od 8.00 ± 0.43 M-1 do 11.90 ± 0.49 M-1. Maksimum reszt tyrptofanowych niedostępnych dla zastosowanego wygaszacza nie zależy od długości fali wzbudzenia i przypada na 338 ± 1 nm. Obliczone rozkłady spektralne oraz stałe Sterna-Volmera wygaszalnej frakcji chromoforów lipazy Rml wskazują na hydrofilowy charakter mikrootoczenia reszt tryptofanowych oraz znaczny stopień ekspozycji reszt do rozpuszczalnika. Nie wykluczone, że reszty (bądź reszta) tryptofanowe dostępne dla wygaszacza zlokalizowane są tuż przy powierzchni molekuły białkowej i w znacznym stopniu związane są z emisją pochodzącą od Trp88. Chromofor ten występuje w krótkim, α-helikalnym odcinku łańcucha polipeptydowego lipazy Rml (reszty: 85-91). Fragment ten, zwany "wieczkiem", bierze bezpośredni udział w aktywacji enzymu.

5

Kinetyka szybkich reakcji dwucząsteczkowych badanych za pomocą wygaszania fluorescencji. [Cz.] 3. Metoda jednofotonowa

Sikorski M.

Wiadomości Chemiczne

|

1998

|

[Z] 52, 1-2

43-55

PL

Często stosowaną metodą rejestracji zaników fluorescencji jest metoda oparta na czasowo skorelowanym zliczaniu pojedynczych fotonów - TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting). Ze względu na swoje zalety, ta metoda detekcji jest często wykorzystywana w badaniach kinetyki wygaszania fluorescencji. Metoda TCSPC została omówiona w licznych monografiach i pracach przeglądowych [1-7]. Niniejszy artykuł nie omawia zatem samej metody detekcji opartej na TCSPC, ma na celu natomiast zwrócenie uwagi na kilka praktycznych aspektów oraz problemów mających znaczenie dla oceny wiarygodności pomiarów wygaszania fluorescencji uzyskiwanych z wykorzystaniem aparatury pracującej na podstawie metody TCSPC. Omówienie przedstawione w tej pracy pomoże, jak mam nadzieję, lepiej zaplanować przyszłe pomiary oraz pozwoli zrozumieć dotychczasowe trudności napotykane w trakcie tego typu badań. Ponadto, w sytuacji gdy kinetyka zaniku fluorescencji donora w obecności wygaszacza jest dyskutowana na podstawie różnych danych uzyskanych z badań doświadczalnych, występujący czasami brak informacji o warunkach i sposobie wykonywania pomiarów utrudnia niezależną interpretację uzyskanych wyników. Niestety, w niektórych pracach poświęconych kinetyce szybkich reakcji dwucząsteczkowych badanych za pomocą wygaszacza fluorescencji podane informacje o warunkach i sposobie wykonywania pomiarów są bardzo skąpe.

EN

The aim of this paper is to review the most widely used technique for studies of fast bimolecular reactions - Time Correlated Single Photon Counting Technique (TCSPCT). The TCSPCT has become one of the most powerful tools to investigate the fluorescence time behaviour. The most prominent point of this method is the use of time-resolved fluorescence quenching as a method for studying diffusion-controlled reactions. The experimentally measured fluorescence decay D(T) is the convolution of the instrument response function E(t) and the fluorescence decay function I(t). The problem to solve is simply to determine the function I(t) when both D(t) and E(t) are known. In practice, however, the problem is highly complicated due to severe experimental distortions and correlations between adjusted parameters. In this paper we have attempted to evaluate the possibilities and limitations of TCSPCT under various conditions in determining the fluorescence quenching kinetics. To investigate fluorescence quenching using SCK theory it is essential to determine the values of R,D and k, because these parameters describe the rate coefficient presents the sum of the diffusion coefficients and R the sum of the radii of the donor in the electronic excited state and of the quencher respectively, and k represents the specific rate constant. However, from the point of view of the fluorescence decay measurement, it is necessary to determine the values of ło, S, Go and L, where Go is a scaling factor. In this paper particular emphasis is placed on the method enabling the determination of the numerical values of E(t) or the elimination of it from the procedure of data fitting according to SCK theory. Table 1 summarises details of experiment when the TCSPCT was employed to study kinetics of fast bimolecular reactions by observation of fluorescence quenching.