Wyniki wyszukiwania - BazTech

Ograniczanie wyników

Powiadomienia systemowe

Sesja wygasła!

Znaleziono wyników: 1

Liczba wyników na stronie

Wyniki wyszukiwania

Wyszukiwano:
w słowach kluczowych: plazmidy

Sortuj według:

Ogranicz wyniki do:

Sekwencje insercyjne i plazmidy bakterii mlekowych w generowaniu różnorodności biologicznej bakterii Bacillus subtilis

Walczak P.

Zeszyty Naukowe. Rozprawy Naukowe / Politechnika Łódzka

2004

Z. 332

3-129

Bakterie mlekowe należące do rodzaju Lactococcus zawierają wiele plazmidów replikujących według dwóch ogólnie znanych mechanizmów, t.j. mechanizmu toczącego się koła (RCR) (ang. rolling circle replication) i typu theta (ang. theta replication). Plazmidy RCR mają zwykle niewielkie rozmiary, do 2-3 tysięcy par zasad (t.p.z.) i zazwyczaj są kryptyczne. Plazmidy typu theta należą do najczęściej spotykanych, mają wielkość od kilku do kilkudziesięciu t.p.z. i kodują wiele ważnych technologicznie funkcji bakterii mlekowych, takich jak fermentacja laktozy, aktywność proteinazowa, mechanizmy fagooporności, produkcja bakteriocyn, produkcja zewnątrzkomórkowych polisacharydów, oporność na jony metali ciężkich i antybiotyki oraz wiele innych cech. Występują zwykle w niewielkiej liczbie kopii na komórkę, ale są stabilne zarówno strukturalnie jak i segregacyjnie. Cechą charakterystyczną większości plazmidów typu theta bakterii Laciococcus jest fakt występowania w ich strukturze wielu różnych sekwencji insercyjnych i transpozonów, które są przyczyną dużej zmienności genetycznej tych bakterii. Sekwencje insercyjne występują również w DNA chromosomalnym bakterii z rodzaju Lactococcus, a ich obecność sprawia, że mogą powodować znaczne przegrupowania w obrębie chromosomu, polegające na inwersji lub delecji dużych fragmentów DNA. Sekwencje insercyjne są zatem aktywnym czynnikiem powodującym różnorodne mutacje i w istotny sposób wpływają na zmienność biologiczną szczepów, wyrażającą się znacznymi różnicami w aktywności tych samych szlaków metabolicznych (np. metabolizm cytrynianu i laktozy) bądź też pojawianiem się całkowicie nowych właściwości (np. produkcja bakteriocyn czy oporność na jony metali ciężkich). Z drugiej strony, bakterie mlekowe z rodzaju Lactococcus mające status organizmów typu GRAS (ang. generally regarded as safe) mogą być wykorzystywane bez ograniczeń jako narzędzia do otrzymywania fermentowanych produktów spożywczych lub też jako dodatki do żywności. Z tego powodu DNA pochodzące z tych bakterii, zarówno chromosomowe jak i plazmidowe, również może być wykorzystywane do modyfikacji innych drobnoustrojów na drodze transformacji. Właściwości sekwencji insercyjnych tych bakterii polegające na wywoływaniu mutacji insercyjnych wydają się zatem bardzo interesującym narzędziem do prób generowania zmienności genetycznej innych gramdodatnich bakterii, np. z rodzaju Bacittus. Celem prezentowanej pracy było sprawdzenie czy DNA plazmidowe i „czyste" DNA sekwencji insercyjnych izolowane z bakterii mlekowych może wywoływać mutacje u bakterii Eacillus subtilis. W tym celu zastosowano technikę transformacji bakterii Bacillus subtilis za pomocą obydwu rodzajów DNA bakterii mlekowych oraz opracowano sposoby wyodrębniania mutantów o zmienionych właściwościach biochemicznych i fizjologicznych. W eksperymentach transformacji Bacillus subtilis z wykorzystaniem plazmidów bakterii mlekowych otrzymano klony o zmienionych cechach morfologicznych i niezdolne do procesu sporulacji. Ponadto szczepy te charakteryzowały się znaczną aktywnością β-galaktozydazy (niewykrywalną u szczepu wyjściowego) oraz opornością na kanamycynę (50 μg*cm-3) i wysokie stężenie jonów kadmu (500 μM). Porównanie wydajności syntezy biomasy szczepu wyjściowego i otrzymanych klonów w pożywce zawierającej laktozę jako źródło węgla wykazało, że szczepy te aktywnie metabotizują laktozę, a ponadto komórki nie przetrwatnikują i nie ulegają autolizie. Otrzymane mutanty wydają się zatem być dobrymi gospodarzami dla rekombinowanych genetycznie plazmidów warunkujących, np. wysoką produkcję enzymów zewnątrzkomórkowych takich jak amylazy, glukanazy czy proteazy. Do transformacji Bacillus subtilis wykorzystano również zmodyfikowany duży plazmid bakterii Lactococcus laclis ssp. lactis var. diacetylactis 239. Modyfikacja ta polegała na jego zmniejszeniu. W wyniku transformacji Bacillus subtilis PSL1, otrzymano szereg transformantów opornych na kanamycynę, a jeden z nich zawierał autonomiczny plazmid, który nazwano pLD239. Udało się zatem przenieść duży plazmid bakterii mlekowych do komórek Bacillus subtilis i uzyskać ekspresję genu oporności na kanamycynę. Określono wielkość tego plazmidu na 26,7 tysięcy par zasad i stwierdzono, że enzym restrykcyjny Sali generuje 4 fragmenty oznaczone F1 - F4 o długości odpowiednio 1,9; 3,8; 7,0 i 14,0 t.p.z. Fragmenty te sklonowano w plazmidzie pUC19, w komórkach Escherichia coli JM101, otrzymując rekombinowane plazmidy pUC19:F1-pLD239, pUC19:F2-pLD239, pUC19:F3-pLD239, PUC19:F4-pLD239. Stwierdzono również, że fragment F2 jest odpowiedzialny za oporność na kanamycynę, a fragment F4 zawiera minimainy replikon funkcjonujący u Bacillus subtilis. Fragmenty F3 oraz F4 plazmidu pLD239 zawierały najprawdopodobniej sekwencje insercyjne gdyż transformacja komórek Bacillus subtilis rekombinowanymi plazmidami pUC19:F3-pLD239 i pUC19:F4-pLD239 prowadziła do otrzymywania mutantów o zmienionych cechach biochemicznych oraz morfologicznych co mogło być wynikiem mutacji insercyjnych. Zastosowano technikę PCR do wyodrębniania sekwencji insercyjnych ISS1 i IS904 z różnych szczepów bakterii Lactococcus lactis, a otrzymane DNA obu sekwencji wykorzystane zostało do transformacji komórek Bacillus subtilis metodą elektroporacji, w wyniku, której izolowano mutanty insercyjne. Ze względu na to, że „czyste" sekwencje insercyjne nie kodują żadnych łatwo wykrywanych cech fenoptypowych to do detekcji mutantów insercyjnych zastosowano różne czynniki selekcyjne, gdyż pod wpływem wprowadzonej sekwencji insercyjnej, komórki bakterii mogą nabywać cechę oporności na kanamycynę i inne antybiotyki, oporność na jony kadmu bądź też detergenty, takie jak np. Tergitol. Otrzymane tą drogą mutanty miary zmienioną morfologię komórek, nie przetrwalnikowary i wytwarzały różnorodne pigmenty oraz charakteryzowały się zmienioną morfologią kolonii. Wykazano, że badane sekwencje insercyjne indukowały u bakterii Bacillus subtilis produkcję substancji o działaniu antybiotycznym w stosunku do innych gatunków bakterii, drożdży i grzybów nitkowatych, co najprawdopodobniej wiązało się z aktywacją genów odpowiedzialnych za biosyntezę bakteriocyn i/lub biosurfaktantów. Niektóre szczepy mutantów insercyjnych charakteryzowały się zwiększonym wydzielaniem specyficznych białek zewnątrzkomórkowych, co może być wykorzystane do skonstruowania wektorów sekrecyjnych w oparciu o sygnały genetyczne sterujące produkcją i wydzielaniem tych białek (sekwencja promotorowa, miejsce wiązania rybosomów, sekwencja peptydu liderowego). Stwierdzono również, że wprowadzenie sekwencji insercyjnej ISS1 i IS904 do komórek Bacillus subtilis może powodować efekt plejotropowy polegający na znacznym ograniczeniu liczby metabolizowanych substratów. Otrzymano mutanty, które metabolizowaly jedynie glukozę i fruktozę spośród 24 substratów węglowodanowych metabolizowanych przez szczep wyjściowy. Obecność sekwencji insercyjnej lSSl i IS904 w komórkach Bacillus subtilis powodowała znaczną niestabilność otrzymanych mutantów, które często podlegały dalszym samorzutnym zmianom cech fizjologicznych i biochemicznych zachodzących prawdopodobnie w wyniku kolejnych transpozycji sekwencji insercyjnej. Zmiany te można było indukować za pomocą niskiej temperatury czy też różnych czynników selekcyjnych. Wykazano że zastosowanie mineralnej pożywki minimalnej Spizizena ze skrobią jako jedynym źródłem węgla do selekcji szczepów, pozwoliło na otrzymanie ze szczepu Bacillus subtilis BGSC1 A2S9/IS904, który asymilował jedynie glukozę i fruktozę, nowych mutantów zdolnych do rozkładu skrobi o znacznie zwiększonej aktywności amylolitycznej w porównaniu do szczepu wyjściowego. Przykład ten wskazuje, że zastosowanie do selekcji niemetabolizowanego substratu przez mutanta Bacillus subtilis BGSC1A289/IS904 prowadzi do aktywacji genów uczestniczących w asymilacji tego substratu. Taka metoda selekcji wydaje się zatem być bardzo pomocna do otrzymywania mutantów aktywnie metabolizujących inne substraty. Niestabilność mutantów insercyjnych polegała również na zmianie barwy kolonii z żółtej na pomarańczową lub czerwoną, z pomarańczowej na żółtą, z gładkiej na szorstką i odwrotnie. Obserwowano również zmiany polegające na przywróceniu funkcji ruchu komórki powstałe prawdopodobnie poprzez odblokowanie mutacji odpowiedzialnej za syntezę rzęsek bakterii. Łatwość z jaką można wprowadzić sekwencje insercyjne do komórek Bacillus subtilts i różnorodność zmian genetycznych obserwowanych pod wpływem tych sekwencji sprawiają, że technika ta może stanowić bardzo cenne narzędzie do badania funkcji genów, zwiększania aktywności różnych szlaków metabolicznych jak i indukcji ekspresji genów nieaktywnych u szczepu wyjściowego np. z powodu braku aktywnego promotora. Mutanty otrzymane tą metodą mogą być wykorzystane bezpośrednio w różnych procesach biotechnologicznych takich jak np. biosynteza enzymów zewnątrzkomórkowych lub substancji antybiotycznych czy też pigmentów komórkowych. Mutanty o pożądanych cechach technologicznych takich jak brak sporulacji, ograniczona lizą komórek, wykorzystywanie tanich odpadowych substratów węglowodanowych, wysoka wydajność syntezy biomasy czy też aktywna sekrecja białek zewnątrzkomórkowych mogą być wykorzystywane jako komórki gospodarza dla procesów biotechnologicznych wykorzystujących technikę rekombinacji DNA. Ponadto analiza genetyczna otrzymanych mutantów może prowadzić do wyjaśnienia mechanizmów regulacji aktywności genów, oznaczenia właściwości genów o dotychczas nieznanej funkcji, a także przyczynić się do poznania interakcji pomiędzy różnymi genami.

Native and recombinant plasmids of lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis 239 as well as PCR amplified DNA of insertion sequences ISS1 and IS904 were applied for transformation of Bacillus subtilis BGSC 1A289 and PSL1. Detection methods of resulting transformants were developed. They allowed for the isolation of mutants with altered biochemical properties, cell and colony morphology, lack of sporulation and mobility. Mutants obtained from transformation of Bacillus subtilis with native plasmid DNA of Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis 239 were characterized with substantial β-galactosidase activity (not present in the parent strain), kanamycin resistance (50μg*cm-1), cadmium ions resistance (500 μM), inability to sporulate and lack of motility and cell lysis. Mutants obtained after transformation of Bacillus subtilis PSL1 with partially digested EcoRI and religated lactococcal plasmid DNA, were kanamycin resistant and one of them contained autonomous plasmid named pLD239 (26.7 kbp). It has been proved that large lactococcal plasmid can be transferred to Bacillus subtilis and function in the heterologous host. Plasmid pLD239 contained four restriction sites for Sail which generated fragments of the following size 1.94, 3.78, 7.0 and 14.02 kbp. Sail fragments were cloned in E. coli and pUC19. Resulting clones were tested for kanamycin resistance and recombinant plasmids used for transformation of Bacillus subtilis. Performed experiments showed that fragment Sail 3.78 kbp conferred kanamycin resistance (in E. coli) and fragment 14.02 kbp contained minimal replicon active in Bacillus subtilis. Remaining fragments 1.94 and 7.0 kbp contained probably insertion sequences causing insertional mutagenesis and generating various types of mutants of Bacillus subtilis (alteration of cell morphology, sporulation, motility, colony pigmentation, stimulation or retardation of enzyme activities). To prove possible mutagenic role of putative insertion sequences present in Sail pLD239 fragments, transformation experiments of Bacillus subtilis with PCR amplified insertion sequences ISS1 and IS904 of lactic acid bacteria were carried out and mutants containing chromosome integrated IS elements were selected. It has been shown, that for the detection of insertion mutants caused by ,,clean" DNA of insertion sequences, various selection factors can be applied. Such transformants can gain antibiotic resistance (i.e. kanamycin), Cd2+ resistance and detergent resistance such as Tergitol. Insertion mutants generated with IS elements with subsequent selection of inhibitor resistant clones did not contained of any selection markers introduced from outside and their resistance was possibly due to the activation of native for Bacillus subtilis multidrug resistance genes. They were characterized with changed cell morphology, inability to sporulate, colony pigmentation and many other features such as activation of certain enzymes, production of antimicrobial substances and extensive alterations of biochemical profiles. Transformation results with ,,clean" IS elements confirmed their mutagenic role when present in lactococcal plasmid DNA. Insertion mutants of Bacillus subtilis containing chromosomally integrated ISS1 and IS904 were unstable and undergone subsequent further transpositions generating new classes of mutants. It has been demonstrated that IS transposition process can be directed by use of selective media for the recovery of expected mutants. Bacillus subtilis BGSC 1A289/IS904 defective in assimilation of many carbon sources , when plated onto minimal medium containing non metabolizable carbon source such as starch, allowed for the isolation of the new transposition mutant BGSC 1 A289/IS904(Amy+) characterized with higher a-amylase activity than parent strain BGSC 1A289. Multiple transposition of ISS1 from mutant BGSC 1A289/ISS1 resulted in activation of biosurfactant production, feature not observed for the parent strain. Presented results of multiple transpositions of IS elements showed that this method can be very useful for the generation of genetic diversity of mutants and activation of inactive or not known yet metabolic pathways in Bacillus subtilis.