Wyniki wyszukiwania - BazTech

Ograniczanie wyników

Znaleziono wyników: 1

Liczba wyników na stronie

Wyniki wyszukiwania

Wyszukiwano:
w słowach kluczowych: mucor circinelloides

Sortuj według:

Ogranicz wyniki do:

Lipazy grzybowe Mucor Circinelloides i Mucor Racemosus:otrzymywanie i katalityczne właściwości

Antczak T.

Zeszyty Naukowe. Rozprawy Naukowe / Politechnika Łódzka

2001

Z. 298

5-169

Większość znanych lipaz to drobnoustrojowe enzymy pozakomórkowe. Wewnątrzkomórkowe lipazy grzybowe należą do grupy szczególnie interesujących enzymów, poznanych w niewielkim stopniu. Brak danych o tych enzymach związany jest zarówno z rzadkim występowaniem w środowisku mikroorganizmów wytwarzających z wysoką wydajnością wewnątrzkomórkowe lipazy, jak i z trudnościami związanymi z wydzielaniem tych enzymów z komórek. W pracy przedstawiono metodę otrzymywania unikatowych, dotychczas nie opisanych w literaturze, preparatów wewnątrzkomórkowych lipaz Mucor circinelloides i Mucor racenwsus, charakterystykę ich właściwości katalitycznych oraz możliwości aplikacyjne. Skład podłoży hodowlanych służących do otrzymywania lipaz optymalizowano metodą gradientową oraz stosowano w skali mikrotechnicznej w fermentorze o objętości roboczej 10 dm3. Opracowano metody otrzymywania rozpuszczalnych preparatów lipaz o różnym stopniu homogenności oraz immobilizowanych (in situ i na różnych nośnikach), przydatnych w reakcjach syntezy estrów i hydrolizy tłuszczów. Stwierdzono, że lipazy te zarówno w środowisku wodnym jak i rozpuszczalników organicznych wykazują specyficzność substratową sn-1,3 względem triacylogliceroli. Są aktywne w środowisku węglowodorów i eterów alifatycznych o współczynniku polamości log P mieszczącym się w zakresie 2,0-8,8. Najwyższą aktywnością charakteryzują się enzymy związane z mycelium (immobilizowane in situ). Badania nad specyficznością lipaz w reakcji syntezy estrów wykazały, że enzymy te katalizują tworzenie estrów kwasów monokarboksylowych C3-C18 i I rzędowych alkoholi alifatycznych C2-C18 z wydajnością 90-98%. Syntezują także estry alkoholi II i in rzędowych z wydajnością 20-30%, estry alkoholi aromatycznych, lakton kwasu 16-hydroksyheksadekanowego (heksadekanolid) z wydajnością 5% oraz poliestry kwasu kwasu 16-hydroksyheksadekanowego z wydajnością 42%. Katalizują również syntezę estrów sacharydów (mono-, di- i tri-) z wydajnością 50-90%. Ustalono, że produktywność procesu syntezy estrów zależy do szeregu czynników środowiska reakcji takich jak: rodzaj rozpuszczalnika organicznego (tzn. jego właściwości, szczególnie wartość logP rozpuszczalnika), stężenie rozpuszczalnika, stężenia molowego substratów, usytuowanie enzymu w środowisku reakcji, temperaturę, czas, pH warstwy wody niezbędnej oraz obecność w środowisku reakcji substancji regulujących aktywność lipaz (aktywatory i inhibitory lipaz w środowisku niewodnym). Wykryto, czego dotychczas nie opisano w literaturze, że pewne substancje chemiczne mogą wywierać dwojakie (ambiwalentne) działanie na katalityczne właściwości lipaz Mucor w środowisku rozpuszczalników organicznych tzn. w zależności od stężenia są one aktywatorami lub inhibitorami tych enzymów. W przypadku syntezy estrów alkoholi alifatycznych są to: dietanoloamina (DEtA), trietanoloamina (TEtA) i piperazyna. W syntezie heksadekanolidu -pirydyna, natomiast w syntezie estrów sacharydów są nimi: bromek cetylo-pirydyniowy i astaksantyna. Stwierdzono, że podobne dwojakie właściwości posiadają również substancje regulatorowe wydzielone z komórek Mucor, które in vitro aktywują lub inhibują, w zależności od ich stężenia, aktywność lipaz w środowisku niewodnym. Brak do tej pory jakichkolwiek wzmianek w literaturze o obecności takich rodzimych substancji w organizmach wytwarzających lipazy. Opracowano dwie bardzo efektywne metody oczyszczania lipaz do stanu, homogennego oraz zbadano katalityczne właściwości homogennych lipaz. Stwierdzono, że w środowisku wodnym z największą szybkością hydrolizują triacyloglicerole w postaci emulsji stabilizowanych alkoholem poliwinylowym. Homogenne lipazy stosowane w układzie dwufazowym rozpuszczalnik organiczny- woda syntezują estry wyższych kwasów tłuszczowych i pierwszorzędowych alkoholi alifatycznych oraz estry sacharydów a nie syntezują acylogliceroli oraz heksadekanolidu. Wyznaczono stałe katalityczne dla lipaz homogennych oraz immobilizowanych in situ i na nośnikach stałych (o charakterze hydrofilowym i hydrofobowym) w reakcjach hydrolizy różnych estrów. Homogenne lipazy, przy stałym stężeniu wody w środowisku, wykazują najwyższe powinowactwo do acylogliceroli wyższych kwasów tłuszczowych oraz skuteczność katalityczną (catalytical efficiency) kcat/KM rzędu 104 w hydrolizie badanych triacylogliceroli. Skuteczność katalityczna lipaz Mucor związanych z mycelium jest rzędu 107, co pozwala je zakwalifikować do enzymów „wysoko skutecznych". Stwierdzono, że powinowactwo lipaz Mucor związanych z mycelium w stosunku do wody (drugiego substratu w reakcji hydrolizy) jest większe aż około 104 razy niż do trioleinianu glicerolu. Fenomenologiczną właściwością homogennych białek lipaz Mucor, dotychczas również nie opisaną w literaturze, jest ich rozpuszczalność i aktywność w środowisku apolamym. Umożliwiła ona wykonanie badań zmiany struktury enzymu w środowisku niewodnym metodą spektrofotometrii różnicowej UV. Wykazały one, że w rozpuszczalnikach organicznych, podobnie jak w wodzie, lipazy mogą ulegać aktywacji. Jej mechanizm może być podobny do aktywacji tych enzymów zachodzącej na granicy faz (aktywacja między fazowa). Sformułowano hipotezę, że podczas regulacji aktywności lipaz w środowisku niewodnym za pomocą substancji dwojakiego działania następują zmiany przestrzennego położenia domeny polipeptydowej „wieczka" lipazy. Zmiany te są wynikiem perturbacji przez te substancje reszty indolowej tryptofanu znajdującej się na zewnątrz tej domeny. Jak wiadomo, przestrzenne położenie „wieczka", zasłaniającego lub odsłaniającego centrum katalityczne, decyduje o aktywności większości lipaz. Badania zmian konformacyjnych enzymów rozpuszczonych w rozpuszczalniku apolarnym są nowością na skalę światową. Wyprowadzono matematyczny model opisujący reakcję enzymatycznej syntezy estrów w środowisku dwufazowym rozpuszczalnik organiczny-woda. Model ten w chwili obecnej najlepiej opisuje powyższe zagadnienie spośród prac zamieszczonych w dostępnej literaturze. Uwzględnia on wzajemne oddziaływanie zarówno składników fizykochemicznych, zależnych od rodzaju rozpuszczalnika, substratów i produktów oraz temperatury jak i składników katalitycznych, wyrażających wzajemne relacje aktywności lipazy ze składnikami fizykochemicznymi modelu (opisane funkcją Ko=F(A)) oraz ilościowych, których wielkość w pewnych granicach można regulować podczas reakcji (stężenie substratów, współczynnik stosunku objętościowego faz (A) i stężenie wody). Zweryfikowano doświadczalnie przydatność tego modelu do przewidywania wydajności reakcji syntezy w stanie poststacjonarnym. Analizowano modelowe syntezy stearynianów: propylu, butylu i oleilu, oleinianów: propylu, butylu i oleilu jak również estrów sacharydów: kaprylanu sacharozy i oleinianu sacharozy. Wysoka zgodność danych doświadczalnych z wartościami wyliczonymi pozwoliła na przeprowadzenie badań symulacyjnych wpływu poszczególnych składników modelu na przewidywaną wydajność reakcji syntezy estrów. Lipazy Mucor w postaci związanej z mycelium zastosowano do hydrolizy różnych surowców tłuszczowych, takich jak: spożywcze i odpadowe tłuszcze roślinne i zwierzęce, uzyskując wolne kwasy tłuszczowe i glicerol z wydajnością do 95%. Enzymy te skutecznie wykorzystano do częściowej hydrolizy odpadowych osadów tłuszczowych (gromadzonych na różnych etapach procesu technologicznego oczyszczalni ścieków), co umożliwia ich przeprowadzenie w emulsję, która może być zawrócona do ponownej utylizacji. Przeprowadzono optymalizację syntezy estrów wyższych kwasów tłuszczowych metodą gradientową. W jej efekcie sumaryczne wyjściowe stężenie kwasu i alkoholu w mieszaninie reakcyjnej zwiększono o ok. 70%, a wydajność estru, dla tej samej masy lipazy, - o 64%. Dla stężeń substratów 2,3 mol/dm3 (70-80%), w skali 0,1 mola, uzyskano stopień konwersji kwasów 85-98%. Opracowano metodę syntezy estrów w skali preparatywnej 0,1-1 mola. Stosując związaną z mycelium lipazę M. circinelloides i substraty o stężeniach wyjściowych 50-80%, uzyskano wydajności od 90 do 95%, co rokuje praktyczne wykorzystanie tej metody do syntezy estrów wyższych kwasów tłuszczowych i I rzędowych alkoholi alifatycznych.

The majority of known lipases are microbial extracellular enzymes. Intracellular fungal lipases belong to a group of particularly interesting and poorly recognized enzymes. The lack of information on these enzymes results both from limited number of their effective natural producers and difficulties with extraction of these enzymes from cells. The thesis presents the method of obtaining of unique, not reported to date, preparations of intracellular lipases from Mucor circinelloides and Mucor racemosus, characteristics of their catalytic properties, and applications. Composition of the growth media utilized for synthesis of the lipases was optimized using the gradient method. The media were applied in the microtechnical scale in 101 fermentors. Methods of production of soluble preparations of lipases having various degree of homogeneity as well as the immobilized ones (in situ and on various carriers), useful for reactions of esters synthesis and fats hydrolysis, were elaborated. It was found out that these lipases display the substrate sn-1,3 specificity towards triacylglycerols, both in aqueous milieu and in organic solvents. They are active in the milieu of hydrocarbons and aliphatic ethers, which polarity coefficient (log P) ranges from 2.0 to 8.8. Most active were mycelium-bound enzymes (immobilized in situ). Studies on the lipases specificity in esters synthesis revealed that the enzymes catalyze synthesis of esters of monocarboxylic C3-C18 acids and primary aliphatic C2-C18 alcohols with 90-98% yield. They also synthesize esters of secondary and tertiary alcohols with 20-30% yield, aromatic alcohols esters, 16-hydroxydecanoic acid lactone (16-hydroxydecanolide) with 5% yield, and polyesters of the latter acid with 42% yield. The enzymes also catalyze synthesis of esters of saccharides (mono-, di- and tri-) with 50-90% yield and sorbitol esters. The yield of esters synthesis appeared to be dependent on conditions such as the type of organic solvent (namely its properties, particularly the value of log P), its concentration, molar concentration of the substrates, enzyme localization in the reaction milieu, temperature, time, pH of the essential water layer, and the presence of substances influencing the lipases activity (activators and inhibitors of lipases in nonaqueous milieu). It was revealed for the first time (a phenomenon not reported before) that some chemical compounds may ambivalently affect catalytic properties of Mucor lipases in organic solvents, namely they activate or inhibit these enzymes, dependency on concentration. Diethanolamine (DEtA), triethanolamine (TEtA) and piperazine play such a role in synthesis of aliphatic alcohols, pyridine in synthesis of hexandecanolide, cethylpyridine bromide and astaxanthin in synthesis of saccharide esters. The similar properties display some ambivalent substances, isolated from Mucor cells, which in vitro, dependently on their concentration,either activate or inhibit the lipases in nonaqueous milieu. Such native substances from lipase-producing microorganisms have not been reported to date. Two very effective methods of the lipases purification to homogeneity were established in this work, and catalytic properties of the homogeneous lipases were determined. It was found out that in water they are most active against triacylglycerols in the form of emulsions stabilized with polyvinyl alcohol. The homogeneous lipases, dissolved in water phase of the biphasic system, synthesize esters of higher fatty acids and primary aliphatic alcohols, and esters of saccharides, whereas they synthesize neither acylglycerols nor hexadecanolide. Catalytic constants for both the homogeneous lipases and the lipases immobilized in situ and on solid carriers (having hydrophilic or hydrophobic character) in hydrolysis of various esters, were estimated. When the water concentration is kept constant, the homogeneous lipases exhibit the highest affinity towards acylglycerols of higher fatty acids, and the catalytic efficiency (kcat/Km) is equal to about 104, in the hydrolysis of these acylglycerols. The catalytic efficiency of the mycelium-bound Mucor lipases amounts to about 107, that enables their classification as highly effective enzymes. The mycelium-bound Mucor lipases affinity towards water, which is the second substrate in hydrolysis, is approximately 104 higher than towards the glycerol trioleate. The unique feature of the homogeneous Mucor lipases, also not reported to date, is their solubility and activity in apolar environment. This property enabled studies on changes in the enzyme structure in nonaqueous milieu, using UV differential spectrophotometry. The investigations indicate that in organic solvents, the lipases are activated like in water. The activation mechanism may be similar to these enzymes activation occurring at the interface of both phases (interfacjal activation). Based on the observations, the hypothesis was postulated. According to the hypothesis, when the lipases are activated with ambivalent substances in nonaqueous milieu, the spatial rearrangement of the lipase "lid" domain occurs. These changes result from the perturbation of the indole group from the tryptophan residue localized in the exterior of this domain, by these substances. As it is well known, the spatial localization of the lipase "lid", which either closes or opens the catalytic center, determines the activity of the majority of lipases. The studies on conformational changes of enzymes soluble in organic solvents have never been carried out before. The mathematic model describing enzymatic synthesis of esters in biphasic system, composed of organic solvent and water, was invented. The model precisely describes the process, and is superior to other reported ones. It takes into consideration mutual relationships of physicochemical components, dependent on the solvent type, substrates, products, and temperature, catalytic components, expressing mutual relations of the lipase activity with the physicochemical model components (described by the function Ko=F(A)), and the quantitative ones, which values can be regulated in a certain range during the reaction (substrates concentrations, the coefficient of phase volume ratio (A) and water concentration). The usefulness of this model for anticipation of the synthesis yield in post-stationary state, was verified experimentally. The analyzed models of synthesis were as follows: stearates and oleates of propyl, butyl and oleyl, and saccharide esters, such as saccharose caprylate and oleate. High compatibility of experimental data and calculated results, enabled simulation studies on the effect of individual model components on the anticipated yield of esters synthesis. The mycelium-bound Mucor lipases were applied for hydrolysis of various fats, such as food and waste, plant and animal fats, giving fatty acids and glycerol with the yield close to 95%. The enzymes were successfully applied for partial hydrolysis of lipids, deposited in various stages of waste water purification, that enables forming of the lipids emulsion, which can be utilized again. The synthesis of esters of higher fatty acids was optimized using the gradient method. As a result, the total initial concentration of acid and alcohol in the reaction mixture was increased by about 70%, and the yield of ester synthesis for the same enzyme - by about 64%. For the substrates concentration equal to 2.3 mol per liter (70-80%), in the 0.1 mole scale, the degree of acids conversion amounted to 85-98%. The method of esters synthesis in the preparative scale of 0.1-1 mole, was elaborated. Using the mycelium-bound M. circinelloides lipase and the initial substrates concentrations of 50-80%, the yields of 90-95% were achieved, that points to the possibility of practical application of this method for synthesis of esters of higher fatty acids and primary aliphatic alcohols.