Wyniki wyszukiwania - BazTech

1

The adjustment of granular sludge DNA isolation for PCR-based methods

Ziembińska-Buczyńska A., Kociołek B., Ślipko K., Daniłowicz A., Cema G., Surmacz-Górska J.

Architecture Civil Engineering Environment

|

2015

|

Vol. 8, no. 2

91--96

EN

European Union regulations require very high standards of wastewater treatment due to both, economic and environmental reasons. Thus wastewater treatment plants are searching for new, efficient technologies to obtain the best quality of WWTPs’ effluent. Among other biological methods granular sludge is known to be effective and useful way for sewage purification due to its better sedimentation properties. Granular sludge is interesting also from microbial ecology point of view. The composition of the granules is very difficult to be analyzed with traditional cultivation methods so molecular tools usage is advisable. In order to perform any molecular analysis DNA isolation is required. In this article we compared two DNA isolation methods – mechanical method and commercial GeneMatrix Soil DNA Isolation Kit (Eurx) and two ways of granular sludge preparation with PBS washing before isolation to check does the method of isolation and preparation influence further laboratory procedures, such as polymerase chain reaction (PCR) amplification and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) separation and fingerprint obtainment. It was stated that there is no influence of the DNA isolation method on the amount of PCR products obtained, but it influences qualitative DGGE resolution and bioinformatical analysis of the results.

PL

Regulacje Unii Europejskiej zaostrzają standardy dotyczące ścieków oczyszczonych, zarówno z powodów ekonomicznych, jak i ochrony środowiska. Dlatego też oczyszczalnie ścieków poszukują nowych, wydajniejszych technologii oczyszczania ścieków. Wśród tych metod osad granulowany wydaje się być efektywną i użyteczną drogą oczyszczania ścieków, ze względu na lepsze niż tradycyjny osad czynny właściwości sedymentacyjne. Osad granulowany jest interesujący również z punktu widzenia ekologii mikroorganizmów. Analiza składu granul jest niezmiernie trudna do wykonania tradycyjnymi metodami mikrobiologicznymi, dlatego też do takich badań niezbędne jest wykorzystanie metod biologii molekularnej. W celu prowadzenia analiz z zakresu biologii molekularnej konieczne jest izolowanie DNA bakteryjnego. W tej pracy podjęto próbę porównania izolacji DNA dwiema metodami – mechaniczną i z użyciem komercyjnego zestawu odczynników GeneMatrix Soil DNA Isolation Kit (Eurx) oraz wykorzystano dwie modyfikacje przygotowania materiału do izolacji poprzez płukanie buforem PBS. Badania miały na celu określenie, czy procedury przygotowawcze i metoda izolacji mają wpływ na efektywność dalszych procedur badawczych, takich jak amplifikacja z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase chain reaction, PCR) oraz rozdział w gradiencie czynnika denaturującego (denaturing gradient gel electrophoresis; DGGE) i uzyskanie wzorów struktury genotypowej zbiorowiska. W badaniach wykazano, że wybór metody izolacji nie ma większego wpływu na ilość uzyskanego produktu PCR, ma jednak wpływ na jakość rozdziału DGGE i wynik analizy bioinformatycznej uzyskanych wyników.

2

Wpływ metod izolacji DNA na podobieństwo genetyczne linii pszenicy ozimej (Triticum aestivum L.) przy zastosowaniu techniki RAPD-Pcr

Tomkowiak A., Kurasiak-Popowska D., Weigt D., Mikołajczyk S.

Aparatura Badawcza i Dydaktyczna

|

2015

|

T. 20, nr 2

90-109

PL

Celem badań było porównanie wpływu 4 metod izolacji DNA na wynik analizy markerami molekularnymi RAPD-PCR (ang. Random Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain Reaction) linii pszenicy ozimej. Przeprowadzono izolację DNA metodą Thomsona i Henry'ego, metodą kolumienkową przy pomocy kitu Quiagen DNeasy Plant Kit, przy pomocy kitu Genomic Mini AX Plant firmy A&A Biotechnology oraz zestawu Maxwell® 16 LEV Plant DNA Kit firmy Promega.Po izolacji przeprowadzono analizy molekularne RAPD-PCR, które wykorzystano jako wskaźnik służący do oceny metod izolacji DNA. Najlepszą metodą izolacji okazała się metoda z wykorzystaniem Quiagen DNeasy Plant Kit. Jakość DNA otrzymanego po izolacji tym kitem była najwyższa, a otrzymane elektroforogramy były najbardziej czytelne. Jest to jednak metoda izolacji DNA najdłuższa i najdroższa, co ogranicza jej wykorzystanie przy dużej liczbie badanych genotypów. Dobrą metodą izolacji DNA ze względu na jakość otrzymanych obrazów elektroforetycznych była metoda izolacji kitem Genomic Mini AX Plant. Metodą szybką i tanią okazała się metoda Thomsona i Henry'ego, niestety mniej wydajną w porównaniu do poprzednich. Metodą o największym zróżnicowaniu ilości otrzymanego DNA była izolacja z wykorzystaniem zestawu Maxwell.

EN

The aim of this study was to compare the effect of 4 DNA isolation methods on the results of analyses using molecular markers of Random Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) in winter wheat lines. DNA was isolated using the method proposed by Thomson and Henry, the column method with a Quiagen DNeasy Plant Kit, a Genomic Mini AX Plant Kit by A&A Biotechnology and the Maxwell® 16 LEV Plant DNA Kit by Promega. After isolation RAPD-PCR analyses were carried out. The molecular study was an evaluation indicator of the DNA isolation methods. The best isolation method was that using the Quiagen DNeasy Plant Kit. Isolation using this kit provided the best DNA quality and the greatest legibility of electropherograms. However, it is the most time- and cost-intensive method of DNA isolation, which limits its applicability at a large number of tested genotypes. In terms of electrophoretic image quality good DNA isolation was provided by the method using a Genomic Mini AX Plant Kit. A rapid and cheap method was that proposed by Thomson and Henry; unfortunately, it was less efficient than the former ones. The greatest variation in the amounts of obtained DNA was observed for isolation using the Maxwell kit.

3

Automatyzacja izolacji DNA z materiałów biologicznych

Staninska J., Szczepaniak J., Piotrowska-Cyplik A., Cyplik P., Czarny J.

Aparatura Badawcza i Dydaktyczna

|

2015

|

T. 20, nr 2

110-121

PL

Intensywny rozwój nauk biologicznych, zarówno w dziedzinie medycyny, kryminalistyki, jak i szeroko rozumianych badań związanych z biotechnologią, stworzył potrzebę doskonalenia technik analitycznych. Na szczególną uwagę zasługują metody biologii molekularnej bazujące na analizie kwasów nukleinowych, charakteryzujące się wysoką czułością i powtarzalnością. Pozwalają one na precyzyjną identyfikację śladów biologicznych, ocenę zmian w profilach ekspresji genów, a także pełną ewaluację bioróżnorodności nisz środowiskowych. Kluczowym elementem determinującym efektywność przeprowadzanych analiz jest etap pozyskiwania (izolacji) materiału genetycznego. Wyraźnie dostrzega się tendencje rozwoju technologii w kierunku zwiększenia przepustowości oraz dokładności izolacji DNA. Aktualnie możliwe jest pokonanie ograniczeń związanych z metodą manualnej izolacji poprzez zastosowanie gotowych zestawów oraz robotów automatycznych umożliwiających pracę z wieloma setkami prób jednocześnie. Celem badań było przeprowadzenie walidacji wybranych metod izolacji genomowego DNA. Wykorzystano trzy komercyjne zestawy. Dwa z nich, dedykowane platformie automatycznej BioRobot M48 Robotic Workstation (Qiagen), bazowały na zjawisku immobilizacji DNA na złożach z cząstkami paramagnetycznymi: QIAsymphony DNA Investigator Kit (Qiagen) oraz MagAttract® DNA Mini M48 (Qiagen). Trzeci zestaw, Sherlock AX (A&A Biotechnology), przeznaczony był do manualnej izolacji genomowego DNA i wykorzystywał mechanizm adsorbcji kwasów nukleinowych na membranach jonowymiennych połączonej ze strącaniem DNA izopropanolem. Ocenie poddano wykrywalność, powtarzalność, i odtwarzalność. Wyniki wskazują, że wszystkie analizowane metody pozwalają na izolację materiału genetycznego o wysokich standardach, który może być wykorzystany w dalszych procedurach badań molekularnych.

EN

The intensive development of biological sciences, both in the field of medicine and broadly defined biotechnology, created the need to improve the analytical techniques. Molecular biology methods based on the analysis of nucleic acids with high sensitivity and reproducibility deserve special attention. They facilitate precise identification of biological traces, assessing changes in gene expression profiles and complete evaluation of environmental niches biodiversity. The main factor determining effectiveness of analysis is a stage of genetic material isolation. There is a clear trend to increase the capacity and accuracy of DNA isolation. Currently it is possible to overcome the limitations associated with manual isolation techniques. Using of kits and automated robots facilitates working with hundreds of samples simultaneously. The aim of the study was to validate the selected genomic DNA isolation methods. Three commercial kits were used. Two of them, which are dedicated to the automatic platform BioRobot M48 Robotic Workstation (Qiagen), are based on the DNA adsorption on silica beads convenient handling of magnetic particles: QIAsymphony Investigator DNA Kit (Qiagen) and MagAttract® DNA Mini M48 (Qiagen). A third kit Sherlock AX (A&A Biotechnology) for manual isolation of genomic DNA are based on the mechanism of nucleic acin adsorption on ion exchange beads combined with the isopropanol precipitation of DNA. The determination limit, reproducibility and repeatability were evaluated. The results indicate that all of the analysed methods allow the isolation of high-quality genetic material, which can be used in subsequent molecular testing procedures.

4

Polymorphism of microsatellite loci - a tool in studying biodiversity of paddlefish aquaculture broodstock

Kaczmarczyk D., Kohlmann K., Kersten P., Luczynski M.

Environmental Biotechnology

|

2007

|

Vol. 3, No. 2

44-48

EN

American paddlefish (Polyodon spathula) is a new species in Polish aquaculture, its broodstocks are few and small, and it is possible that all mature fish originated from only a few spawners. Studies on polymorphism of highly variable microsatellite DNA allow revealing genetic characteristics of individual spawners as well as estimation of genetic variation within and divergence between broodstocks. This paper describes optimised protocols for isolation of DNA from fin tissues, amplification of nine microsatellite loci using PCR technique, and for fish genotyping using automatic capillary DNA sequencer. Our technique was tested towards the fin samples taken from all paddlefish reared in Poland and approaching their sexual maturity; the study included also samples taken from 47 fish of the Ukrainian breeding center (Gorny Tykich).