Wyniki wyszukiwania - BazTech

Ograniczanie wyników

2 Chemia Analityczna

Znaleziono wyników: 2

Liczba wyników na stronie

Wyniki wyszukiwania

Wyszukiwano:
w słowach kluczowych: human blood plasma

Sortuj według:

Ogranicz wyniki do:

Capillary electrophoretic analysis of the stability of RNA-peptide complex in human blood plasma

Mucha P., Szyk A., Rekowski P., Barciszewski J.

Chemia Analityczna

2004

Vol. 49, No. 6

845-853

Capillary electrophoresis mobility shift assay (CEMSA) was employed to qualitatively study the stability of RNA and RNA-peptide complex in human blood plasma. RNA-protein interactions play an important role in the replication cycle of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Thus, the CEMSA method was adapted to study the interactions between viral trans-activation response element (TAR RNA) and the arginine-rich fragment (49-57) of viral trans-activation protein Tat HIVn1. The stability of the free and peptide- complexed TAR in human blood plasma was investigated using a polyacrylamide (LPA)-coated capillary and a sieving matrix with the separation buffer. Under the applied conditions the studies on micromolar concentrations of TAR could be performed without labelling in less than 30 min. In the presence of Tat peptide, a significant increase of the migration time of TAR from 18.66 min to 20.12 min was observed. The differences between the behaviour of the free and complexed TAR in human blood plasma were apparent during CEMSA analysis. Both species degraded progressively in time. The first products of degradation were detected immediately after spiking the plasma sample with the free TAR. Migration times of the degradation products were longer than for the free TAR. Free TAR was degraded completely after 60 min. Since TAR was unlabelled, the products of its degradation could not be identified. TAR complexed with the Tat-peptide was much more stable in plasma compared to the free TAR. Even after 180 min of incubation a large amount of the complexed TAR still could be detected. This work is the first to present the application of CE to the stability studies of the free and peptide-complexed RNA in human blood plasma.

Przedstawiono metodę elektroforezy kapilarnej do jakościowej oceny stabilności RNA i kompleksu RNA-peptyd w plazmie ludzkiej krwi. Z powodu dużego znaczenia oddziaływań RNA-białko w cyklu replikacyjnym wirusa HIV-1, metodę zaadaptowano do badań oddziaływań slruktury TAR RNA z bogatym w argininę fragmentem (49-57) wirusowego biafka transaktywowanego Tat HIV-1. Oddziaływanie TAR-Tat jest odpowiedzialne za efektywną clongację wirusowego mRNA. Używając pokrytej poliakryloamidem (LPA) kapiiary i buforu zawierającego czynnik przesiewający badano stabilność wolnego i skomplcksowanego z peptydem TAR. Zastosowane warunki pozwoliły na badanie stabilności kompleksu TAR-Tat bez znakowania RNA, w stężeniu mikromolowym w czasie krótszym niż 30 min. W obecności Tat pcptydu zaobserwowano znaczące przesunięcie czasu migracji TAR od 18.66 do 20.12 min. Zachowanie wolnego i skompleksowancgo TAR było łatwo obser-wowalne przy zastosowaniu CE. Pierwsze produkty degradacji zaobserwowano natychmiast po zmieszaniu wolnego TAR z próbką plazmy. Czasy migracji tych produktów były dłuższe niż wolnego TAR. Całkowita degradacja TAR nastąpiła po l godz. TAR skompleksowany z Tat pcptydem był znacznie stabilniejszy w plazmie w porównaniu do wolnego TAR, Czasy migracji produktów degradacji przypominały te obserwowane w wypadku wolnego TAR. Prezentowana procedura opisuje po raz pierwszy zastosowanie CE do badania zachowania wolnego i skompleksowancgo zpeptydem RNA w ludzkiej plazmie krwi.

Determination of selected oxycholesterols in human blood plasma by means of thin-layer chromatography with densitometry

Janoszka B., Tyrpień K., Wielkoszyński T., Dobosz C., Bodzek D., Bodzek P., Olejek A.

Chemia Analityczna

2001

Vol. 46, No. 1

11-21

Selected oxycholesterols: 5-cholesten-3|3-ol-7-one, sum of 5-cholestene-3p,7p-diol and 5-choleslene-3p,7a-diol, sum of 5alpha,6alpha-epoxycholestan-3p-ol and 5p,6p-epoxycho-lestan-3p-ol were determined in human blood plasma samples by the use of TLC with densitometry. The plasma was hydrolysed with ethanol solution of KOH and then extraction of lipids with n-hexane was performed. After cleanup of organic phase on silica gel SPE cartridges, oxycholesterols fraction was eluted with 2-propanol in n-hexane. Next, the fraction, after separation by TLC, was quantificated by densitometry. For the determination of 5-cholesten-3beta-ol-7-one and sum of 5-cholestene-3p,7p-diol and -3p,7a-diol the plates coated with silica gel and acetone with chloroform (1:9,v/v) as mobile phase were used. RP-18 stationary phase and 3% 2-propanol in dichloromethane solution was used for the sum of 5beta,6beta- and 5alpha,6alpha-epoxycholestan-3p-ol determination. Quantitation was carried out after Liebermann-Burchard reaction for all oxycholesterols, except 5-choles-ten-3beta-ol-7-one, for which visualization and determination was performed under UV light (X = 239 nm). Recoveries from plasma spiked with known amount of 5-choles -ten-3beta-ol-7-one as well as sensitivity and repeatability of this method were sufficient.

Opracowano procedurę densytometrycznego oznaczania wybranych oksycholesteroli: 5-cholesten-3alfa-ol-7-onu, sumy 5-cholesten-3beta7beta-diolu i 5-cholesten-3p,7a-diolu oraz sumy 5alpha,6alpha-epoxycholestan-3beta-olu i 5beta, 6beta-epoxyxholestan-3beta-olu wyizolowanych z osocza krwi i rozdzielonych techniką TLC. Lipidy ekstrahowano n-heksanem z osocza poddanego wcześniej hydrolizie alkalicznej za pomocą etanolowego roztworu KOH. Frakcje oksycholesteroli wyodrębniono z ekstraktu lipidów techniką SPE stosując kolumienki wypełnione żelem krzemionkowym oraz elucję roztworem 2-propanolu w heksanie. W celu oznaczenia 5-cholesten-3beta-ol-7-onu oraz sumy 5-cholesten-3beta,7p-dioIu i -3beta,7onu-diolu rozdziały TLC prowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym stosując mieszaninę acetonu i chloroformu (9:1, v/v) jako fazę ruchomą. Dla oznaczenia sumy 5beta,6beta- i 5alpha,6alpha-epoxycholestan-3beta-olu rozdział prowadzono w układzie RP-18/2-propanol-dichlorometan (3:97, v/v). Pomiar densytometryczny fiuores-cencji lub reflektancji powstałych produktów reakcji z odczynnikiem Liebermanna-Burcharda był podstawą oznaczeń ilościowych wszystkich badanych oksycholesteroli, za wyjątkiem 5-cholesten-3beta-ol-7-onu, który jako związek wykazujący absorpcję w zakresie UV (Lambda = 239 nm), mógł być oznaczany bezpośrednio po rozwinięciu chromatogramu. Odzysk 5-cholesten-3beta-ol-7-onu dodanego do osocza wynosił 90% a powtarzalność oznaczeń oksycholesteroli w osoczu wynosiła 10-20%.