Zastosowanie metod fluorescencyjnych w badaniu stopnia ekspozycji reszty tryptofanowej W89 białka i lipazy z Humicola lanuginosa

• Autorzy: Stobiecka A.

Warianty tytułu

EN

Determination of exposure degree of tryptophyl residue W89 within lipase from Humicola lanuginosa by fluorescence methods

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

W prezentowanym artykule zostały przedstawione wyniki badań naturalnej fluorescencji molekuły lipazy pleśniowej z Humicola lanuginosa. W przeprowadzonych eksperymentach zastosowano technikę wygaszania emisji reszt tryptofanowych białka lipazy jonami I- w celu zbadania zmian konformacyjnych katalitycznego obszaru enzymu. Zgodnie z rezultatami wykonanych pomiarów, trzy spośród czterech reszt tryptofanowych (tj.: W/77, W221 oraz W260) stanowią frakcją niewygaszalną jonami I- zaś jedynie reszta W89 dostępna jest dla zastosowanego wygaszacza. Wyniki badań porównawczych przeprowadzonych dla natywnej oraz zainhibowanej formy lipazy świadczą o tym, iż stopień ekspozycji reszty W89 jest bezpośrednio skorelowany z lokalizacją α-helikalnego fragmentu lańcucha polipeptydowego lipazy, tzw. "wieczka", względem szkieletu białkowego enzymu. W czasie przejścia konformacyjnego z "zamkniętej" (natywnej) do "otwartej" (zainhibowanej) formy biokatalizatora obserwowany jest wzrost wartości stałej Sterna-Volmera wyznaczonej dla reszty W89 od 3,29 M-1 do 4.23 M-1 (λex=295 nm).

EN

The steady-state fluorescence quenching measurements have been performed to study different forms of the fungal lipase from Hurmcola lantiginosa (HLL). The intrinsic fluorescence of W89 residue, located in the 'lid' region, has been used as a probe for the dynamics of protein. The iodide-quenching data showed that three of four tryptophans (i.e. W117, W221 and W260 residue) within HLL lipase were totally inaccessible to the quencher. On the contrary, W89 residue was available for I-. Using steady-state iodide fluorescence quenching data and the fluorescence quenching-resolved-spectra (FQRS) method the total emission spectrum of the native lipase has been decomposed into two spectral components. One of them, unquenchable by iodide, has a maximum of fluorescence emission at the range: 333-337 nm and the second one, exposed to the solvent, emits at 343-346 nm (at λex between 295 and 305 nm, respectively). The resolved spectrum of the redder component corresponds to die W89 residue which participates in about 70% of the total HLL emission. The dynamic Stern-Volmer quenching constants calculated for native ('closed-lid') and inhibited ('open-lid') lipase were: 3.29 M-1 and 4.23 M-1, respectively. The values obtained indicate that W89 is not deeply buried in the protein matrix. The steady-state fluorescence quenching studies of native and inhibited HLL lipase with potassium iodide show that two different conformations of the enzyme caused by limiting movement of the short a-helical 'lid' can be monitored using fluorescence properties of W89 residue.

Słowa kluczowe

PL

Humicola lanuginosa; lipaza; reszta tryptofanowa W89; fluorescencja białek

EN

Humicola lanuginosa; lipase; tryptophyl residue W89; protein fluorescence

• Wydawca: Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej
• Czasopismo: Zeszyty Naukowe. Chemia Spożywcza i Biotechnologia / Politechnika Łódzka
• Rocznik: 1999
• Tom: Z. 61
• Strony: 5--18
• Opis fizyczny: Bibliogr. 28 poz.

Twórcy

autor

Stobiecka A.

• Instytut Podstaw Chemii Żywności PŁ