PCR-RAPD optimization for hospital wastewater genotoxic influence analysis on Allium cepa root meristem cells

• Autorzy: Szulc M. , Zgórska A. , Ziembińska A.
• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction – Random Amplified Polymorphic DNA) is a PCR based method used for biodiversity, phylogenetics, genotoxicity and cancerogenesis research. It possesses several advantages, such as no necessity for information about DNA sequence or multiple primers usage for generating a great deal of fingerprints data. But on the other hand PCR-RAPD is known to be unrepeatable and generating unspecific PCR products, if PCR is not optimized for a particular biological material. The aim of this experiment was to optimize PCR-RAPD with a modified Taguchi method for its usage for genotoxicity analysis. The research was performed on DNA isolated from onion (Allium cepa) root meristem cells. The plants were grown on medium containing an increasing concentration of hospital wastewater in order to observe its genotoxic influence on eukaryotic DNA. The wastewater derived from Hospital for Phthisiatry and Lung Diseases in Pilchowice, Poland, where large amount of anti-tuberculosis and anti-cancer drugs are used. The research proved modified Taguchi method being useful for optimal PCR mixture. In the experiment repeatable RAPD results with no additional nonspecific PCR products were received. It was also stated that PCR-RAPD is useful for genotoxicity analysis performed with plant DNA.

PL

PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction – Random Amplified Polymorphic DNA) jest odmianą PCR wykorzystywaną w badaniach bioróżnorodności, filogenezy, genotoksyczności oraz kancerogenezy. Do jej zalet zalicza się brak konieczności znajomości badanej sekwencji DNA oraz możliwość użycia wielu rodzajów starterów reakcji. Z drugiej strony jednak wyniki uzyskiwane tą metodą są uznawane za niepowtarzalne, a w reakcji PCR generowane są często niespecyficzne produkty, jeśli metoda nie jest zoptymalizowana do badanego materiału. Celem tego eksperymentu była optymalizacja techniki PCR-RAPD za pomocą zmodyfikowanej metody Taguchi, wykorzystanej do badań nad genotoksycznością ścieków szpitalnych. Badania prowadzono na DNA izolowanym z komórek merystemów korzenia cebuli (Allium cepa), hodowanych na pożywce zawierającej rosnące stężenia ścieków szpitalnych, pochodzących ze Szpitala Chorób Płuc w Pilchowicach, uznawanych za potencjalnie genotoksyczne w stosunku do komórek eukariotycznych, ze względu na wysoką zawartość pozostałości leków przeciwgruźlicznych i antynowotworowych. Przeprowadzone analizy udowodniły użyteczność zmodyfikowanej metody Taguchi do optymalizacji składu mieszaniny reakcyjnej do techniki PCR-RAPD. Uzyskane wyniki były powtarzalne, a w trakcie reakcji nie generowano niespecyficznych produktów PCR. Stwierdzono również użyteczność metody PCR-RAPD do analiz genotoksyczności z użyciem roślinnego DNA.

Słowa kluczowe

EN

Allium cepa; genotoxicity; hospital wastewater; modified Taguchi method; ecotoxicology

PL

Allium cepa; genotoksyczność; ścieki szpitalne; optymalizacja PCR-RAPD; zmodyfikowana metoda Taguchi; ekotoksykologia

• Wydawca: Silesian University of Technology
• Czasopismo: Architecture Civil Engineering Environment
• Rocznik: 2012
• Tom: Vol. 5, no. 1
• Strony: 79--86
• Opis fizyczny: Bibliogr. 16 poz.

Twórcy

autor

Szulc M.

autor

Zgórska A.

autor

Ziembińska A.

• Faculty of Energy and Environmental Engineering, The Silesian University of Technology, Akademicka 2, 44-100 Gliwice, Poland,

Bibliografia

• [1] Turner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H.; Krótkie wykłady: Biologia molekularna. (Short lectures: Molecular biology), PWN, Warszawa, 2005 (in Polish)
• [2] Atienzar F.A., Jha A.N.; The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review. Mutation Research, Vol.613, 2006; p.76-102
• [3] Jones C., Kortenkamp A.; RAPD library fingerprinting of bacterial and human DNA: applications in mutation detection. Teratogen. Carcinogen. Mutagen, No.20, 2000; p.49-63
• [4] De Wolf H., Blust R., Backeljau T.; The use of RAPD in ecotoxicology. Mutation Research, Vol.566, 2004; p.249-262
• [5] Freeland J.R.; Ekologia molekularna (Molecular ecology). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2008 (in Polish)
• [6] Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.; PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich Publishers, 1990
• [7] Mullis K.B.; The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribunuclear fusion. PCR Method Application, Vol.1, 1991; p.1-4
• [8] Cobb B.D., Clarkson J.M.; A simple procedure for optimizing the polymerase chain reaction (PCR) using modified Taguchi method. Nucleic Acids Research, Vol.22, No.18, 1994; p.3801-3805
• [9] Atienzar F., Evenden A., Jha A., Savva D., Depledge M.; Optimized RAPD Analysis Generates High-Quality Genomic DNA Profiles at High Annealing Temperature. BioTechniques, Vol.28, 2000; p.52-54
• [10] Qari S.H.; DNA-RAPD Fingerprinting and Cytogenetic Screening of Genotoxic and Antigenotoxic Effects of Aqueous Extracts of Costus Specious (Koen.). JKAU: Science, Vol.22, No. 1, 2010; p.133-152
• [11] Mędrala D., Dąbrowski W., Czekajło-Kołodziej U., Daczkowska-Kozon E., Koronkiewicz A., Augustynowicz E., Manzano M.; The possible effect of a sanitization program on intraspecies differentiation of Listeria monocytogenes strains isolated from a fish processing plant. International journal of hygiene and environmental health. Vol.206, No.6, 2003; p.583-90
• [12] Stefańska I., Rzewuska M., Binek M.; Evaluation of three methods for DNA fingerprinting of Corynebacterium pseudotuberculosis strains isolated from goats in Poland. Vol.57, No.2, 2008; p.105-112
• [13] Bogusławska-Wąs E., Czekajło-Kołodziej U., Mędrala D., Dąbrowski W.; Intraspecific or Intraspecies Differentiation of Saccharomyces cerevisiae Strains Isolated from Fish, Sewage and Odra Waters Based on Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR) Technique. Polish Journal of Environmental Studies, Vol.16, No. l, 2007; p. 17-22
• [14] Fritsch P., Rieseberg E.H.; The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in conservation genetics, in: Smither T.B., Wayne R.K. (Eds.), Molecular Genetic Approaches in Conservation, Oxford University Press, 1996; p.55-73
• [15] Noel S., Rath K. S. ; Randomly amplified polymorphic DNA as a tool for genotoxicity: an assessment. Toxicology and Industrial Health, Vol.22, 2006; p.267-275
• [16] Orieux N., Cambier S., Gonzalez R, Morin B.; Genotoxic damages in zebrafish submitted to a poly-metallic gradient displayed by the Lot River (France). Ecotoxicology and Environemntal Health, Vol.74, 2011;p.974-983