Capillary electrophoretic analysis of the stability of RNA-peptide complex in human blood plasma

• Autorzy: Mucha P. , Szyk A. , Rekowski P. , Barciszewski J.

Warianty tytułu

PL

Analiza trwałości kompleksu RNA-pepted w plazmie ludzkiej krwi metodą elektroforezy kapilarnej

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

Capillary electrophoresis mobility shift assay (CEMSA) was employed to qualitatively study the stability of RNA and RNA-peptide complex in human blood plasma. RNA-protein interactions play an important role in the replication cycle of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Thus, the CEMSA method was adapted to study the interactions between viral trans-activation response element (TAR RNA) and the arginine-rich fragment (49-57) of viral trans-activation protein Tat HIVn1. The stability of the free and peptide- complexed TAR in human blood plasma was investigated using a polyacrylamide (LPA)-coated capillary and a sieving matrix with the separation buffer. Under the applied conditions the studies on micromolar concentrations of TAR could be performed without labelling in less than 30 min. In the presence of Tat peptide, a significant increase of the migration time of TAR from 18.66 min to 20.12 min was observed. The differences between the behaviour of the free and complexed TAR in human blood plasma were apparent during CEMSA analysis. Both species degraded progressively in time. The first products of degradation were detected immediately after spiking the plasma sample with the free TAR. Migration times of the degradation products were longer than for the free TAR. Free TAR was degraded completely after 60 min. Since TAR was unlabelled, the products of its degradation could not be identified. TAR complexed with the Tat-peptide was much more stable in plasma compared to the free TAR. Even after 180 min of incubation a large amount of the complexed TAR still could be detected. This work is the first to present the application of CE to the stability studies of the free and peptide-complexed RNA in human blood plasma.

PL

Przedstawiono metodę elektroforezy kapilarnej do jakościowej oceny stabilności RNA i kompleksu RNA-peptyd w plazmie ludzkiej krwi. Z powodu dużego znaczenia oddziaływań RNA-białko w cyklu replikacyjnym wirusa HIV-1, metodę zaadaptowano do badań oddziaływań slruktury TAR RNA z bogatym w argininę fragmentem (49-57) wirusowego biafka transaktywowanego Tat HIV-1. Oddziaływanie TAR-Tat jest odpowiedzialne za efektywną clongację wirusowego mRNA. Używając pokrytej poliakryloamidem (LPA) kapiiary i buforu zawierającego czynnik przesiewający badano stabilność wolnego i skomplcksowanego z peptydem TAR. Zastosowane warunki pozwoliły na badanie stabilności kompleksu TAR-Tat bez znakowania RNA, w stężeniu mikromolowym w czasie krótszym niż 30 min. W obecności Tat pcptydu zaobserwowano znaczące przesunięcie czasu migracji TAR od 18.66 do 20.12 min. Zachowanie wolnego i skompleksowancgo TAR było łatwo obser-wowalne przy zastosowaniu CE. Pierwsze produkty degradacji zaobserwowano natychmiast po zmieszaniu wolnego TAR z próbką plazmy. Czasy migracji tych produktów były dłuższe niż wolnego TAR. Całkowita degradacja TAR nastąpiła po l godz. TAR skompleksowany z Tat pcptydem był znacznie stabilniejszy w plazmie w porównaniu do wolnego TAR, Czasy migracji produktów degradacji przypominały te obserwowane w wypadku wolnego TAR. Prezentowana procedura opisuje po raz pierwszy zastosowanie CE do badania zachowania wolnego i skompleksowancgo zpeptydem RNA w ludzkiej plazmie krwi.

Słowa kluczowe

EN

capillary electrophoresis; RNA-peptide complex; stability; human blood plasma

PL

elektroforeza kapilarna; kompleks RNA-pepted; stabilność; krew ludzka

• Wydawca: Komitet Chemii Analitycznej PAN
• Czasopismo: Chemia Analityczna
• Rocznik: 2004
• Tom: Vol. 49, No. 6
• Strony: 845--853
• Opis fizyczny: Bibliogr. 18 poz.

Twórcy

autor

Mucha P.

• Department of Chemistry, University of Gdansk, ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdansk, Poland

autor

Szyk A.

• Department of Chemistry, University of Gdansk, ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdansk, Poland

autor

Rekowski P.

• Department of Chemistry, University of Gdansk, ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdansk, Poland

autor

Barciszewski J.

• Institute of Bioorganic Chemistry, ul. Noskowskiego 12, 61-704 Poznan, Poland

Bibliografia

• 1. Karger B.L., Chu Y.H. and Foret F., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 24, 579 (1995).
• 2. Karger B.L., Foret F. and Berka J., Methods Enzymol., 271, 293 (1996).
• 3. Katsivela E. and Hofle M.G., J. Chromatogr. A, 700, 125 (1995).
• 4. Guetens G., Van Cauwenberghe K., De Boeck G., Maes R., Tjaden U.R., van der Greef J., Highley M., van Oosterom A.T. and de Bruijn E.A., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., 739, 139 (2000).
• 5. Zhang B., Xue H. and Lin B., Chromatographia, 48, 268 (1998).
• 6. Mucha P., Szyk A., Rekowski P. and Barciszewski J., J. Chromatogr. A, 968, 211 (2002).
• 7. Mucha P., Szyk A., Rekowski P., Guenther R. and Agris P.F., RNA, 8, 698 (2002).
• 8. Karn J., J. Mol. Biol., 293, 235 (1999).
• 9. Rana T.M. and Jeang K.T., Arch. Biochem. Biophys., 365, 175-(1999) 85.
• 10. Gaynor R.B., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 193, 51 (1995).
• 11. Jones K.A. and Peterlin B.M., Annu. Rev. Biochem., 63, 717 (1994).
• 12. Jeang K.T., Xiao H. and Rich E. A., J. Biol. Chem., 274, 28837 (1999).
• 13. Kuppuswamy M., Subramanian T., Srinivasan A. and Chinnadurai G., Nucl. Acids Res., 17, 3551 (1989).
• 14. Aboul-ela F., Karn J. and Varani G., Nucl. Acids Res., 24, 3974 (1996).
• 15. Ippolito J.A. and Steitz T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 9819 (1998).
• 16. Edwards T.E., Okonogi T.M. and Sigurdsson S.T., Chem. Biol., 9, 699 (2002).
• 17. Denton, K.A. and Harris, R., J. Chromat. A, 705, 335 (1995).
• 18. Vincenzi Jager V., Franco A. and Tavares, M., J Chromat B, Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 785, 285 (2003).