Determination of 2,6-diaminopimelic acid in rumen bacteria by various high-performance liquid chromatography methods with pre-column derivatization

• Autorzy: Czauderna M. , Kowalczyk J. , Kwiatkowska E.

Warianty tytułu

PL

Oznaczanie kwasu 2,6-diaminopimelinowego w bakteriach żwacza różnymi metodami wysokosprawnej chromatografii cieczowej przy użyciu przedkolumnowej derywatyzacji

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

New high-performance liquid chromatography methods were used in the analysis of total or partly separated stereoisomers of 2,6-diaminopimelic acid(DAPA) in rumen bacterial samples after hydrolysis with HCI. DAPA was determined after pre-column derivatization with ()-phthaldialdehyde (OPA) in the presence of 2-mercaptoethanol (E(OH)SH) or ethanethiol (ESH). DAPA derivatives were analyzed using a reversed-phase column with UV detection at 340 nm. Two binary gradient programs were used for analysis of DAPA derivatives. The derivatization procedures are based on DAPA conversion with OPA/E(OH)SH (method I) or with OPA/ESH (method 2). Theretention times were 26.87:f:0.19 and 27.81:f:0.24 min for DAPA stereoisomers (method I) and 37.67:f:0.33 min for total DAPA derivatives (method 2). The new procedure of method 2 enabled clear separation of DAP A stereoisomers as one peak, allowing better reliability of this method. The total run time of the HPLC analyses was 55 min. The analytical recoveries of DAPA standards added to bacterial samples ranged from 96.5 to 102.1 % for both methods. The low inter- and intra-assay coefficient of variation, high recoveries and low limits of detection, point to satisfactory precision, accuracy and sensitivity of the reported methods. The combination of the pre-concentration procedure and HPLC separation by method I or 2 provides an adequate tool for determination of relatively low levels of DAP A in biological samples.

PL

Ilość białka bakteryjnego produkowanego w żwaczu można oznaczyć na podstawie stężenia kwasu 2,6-diaminopimelinowego (DAPA). Dlatego też opracowano nowe metody HPLC, kt6re pozwoliły na oznaczanie DAPA w analizowanych pr6bkach bakterii żwacza. Analizowane związki rozdzielano na kolumnie w odwróconym ukła-dzie faz poprzez elucję gradientową oraz detekcję U V przy 340 nm. Przeprowadzając OAPA w pochodne przy użyciu o-ftaldialdehydu (OPA) oraz 2-merkaptoetanolu (E(OH)SH) (metoda I) uzyskano częściowy rozdział stereoizomerów OAPA. Rozdział chromatograficzny prowadził do pojawienia się dwóch pików OAPA o czasach retencji 26,87+0,19 min DD i LL stereoizomery) oraz 27,81:t0,24 min (me.~o stereoizomer). Przeprowadzając OAPA w pochodne przu użyciu OPA oraz etanotiolu (ESH) (metoda 2) uzyskano tylko jeden pik będący sumą wszystkich stereoizomerów OAPA. Zatem wszystkie stereoizomery mając ten sam czas retencji (37.67:t0,33 min) dają na chroma-togramie pik o odpowiednio większej powierzchni. Uzyskując większy i lepiej ukształ-towany pik, można z lepszym skutkiem oznaczać OAPA w analizowanych próbkach. Całkowity czas rozdziału chromatograficznego wynosił 55 min. Uzyskany odzysk standardów OAPA dodanych do analizowanych próbek dla obydwu metod zawierał się w granicach od 96,6 do 102,1 %. Niskie wartości współczynnika zmienności wobrębie przeprowadzania w pochodne i iniekcji prób oraz niskie wartości granic detekcji sprawiają, że prezentowane metody HPLC charakteryzują się zadowalającą precyzją, dokładnością i czułością. W celu umożliwienia oznaczania ekstremalnie niskich pozio-mów OAPA w materiał ach biologicznych opracowano metodę 3. OAPA przeprowadzo-no w pochodne przy użyciu OPA w obecności E(OH)SH lub ESH dopiero po usunięciu nadmiaru innych aminokwasów. Pozwoliło to na znaczne podniesienie czułości, sele-ktywności i precyzji oznaczania ultraśladowych ilości DAPA.

Słowa kluczowe

EN

2,6-diaminopimelic acid; bacteria; determination; liquid chromatography; HPLC

PL

kwas 2,6-diaminopimelinowy; bakterie; oznaczanie; chromatografia cieczowa

• Wydawca: Komitet Chemii Analitycznej PAN
• Czasopismo: Chemia Analityczna
• Rocznik: 1999
• Tom: Vol. 44, No. 2
• Strony: 243--255
• Opis fizyczny: bibliogr. 24 poz.

Twórcy

autor

Czauderna M.

• The Kielanowski Institute of Animal Physiology and Nutrition Polish Academy of Sciences, 05-110 jabłonna, Poland

autor

Kowalczyk J.

• The Kielanowski Institute of Animal Physiology and Nutrition Polish Academy of Sciences, 05-110 jabłonna, Poland

autor

Kwiatkowska E.

• The Kielanowski Institute of Animal Physiology and Nutrition Polish Academy of Sciences, 05-110 jabłonna, Poland

Bibliografia

• 1. Ling J.R., In: The rumen ecosystem. The microbial metabolism and its regulation, [Hoshino S., Onodera R., Minato H. and Itabashi H., Eds.], Japan Scientific Societies Press, Tokyo 1990, p. 83.
• 2. Nagasawa T., Ling J.R. and Onodera R., J. Chromatogr. A, 653, 336 (1993).
• 3. Nanninga N., Wientjes F.B., Mulder E. and Woldringu C.L., In: Prokaryotic structure and function. A new perspective, [So Mohau, C. Dow, J.A. Cole, Eds.], Cambridge University Press, Cambridge 1992, p. 185.
• 4. Schleifer K.H. and Seidl P.H., In: Chemical methods in bacterial systematics, Vol. 20, [M. Goodfellow, D. Minnikin, Eds.], Academic Press, New York 1985, p. 201.
• 5. Puchala R., Piór H., Kulasek G.W. and Shelford J.A., J. Chromatogr., 63, 63 (1992).
• 6. Masson H.A., Denholm A.M. and Ling J.R., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1714 (1991).
• 7. Mzik J., Hogan J.P., Lindsy J.R. and Davis P., J. Chromatogr., 152, 269 (1978).
• 8. Hutton K., Bailey F.J. and Annison E.F., Br. J. Nutr., 25, 165 (1971).
• 9. Czerkawski J.W., J. Sci. Food Agric., 25, 45 (1974).
• 10. Sarwar G. and Botting H.G., J. Chromatogr., 615, 1 (1993).
• 11. Webster P.M., Hoover W.H. and Miller T.K., Anim. Feed Sci. Technol., 30, 11 (1990).
• 12. Lindrth P., Hamberger A. and Sandberg M., In: The Humana, Vol. 3, [A.A. Boulton, G.B. Baker, J.D. Woods, Eds.], Press. Inc., 1985, pp. 97-116.
• 13. Robinson P.H., Fadel J.G. and Ivan M., Can. J. Anim. Sci., 76, 587 (1996).
• 14. El-Waziry A.M., Tomita Y., Ling J.R. and Onodera R., J. Chromatogr. B, 677, 53 (1996).
• 15. Zanol M. and Gastaldo L., J. Chromatogr., 536, 211 (1991).
• 16. Dugan M.E.R., Sauer W.C., Lien K.A. and Fenton T.W., J. Chromatogr., 852, 242 (1992).
• 17. El-Shazly K. and Hungate R.E., Appl. Microbiol., 14, 7 (1966).
• 18. Chen X.B., Kyle D.J. and Ørskov E.R., J. Chromatogr., 617, 241 (1993).
• 19. Balcells J., Guada J.A. and Peiro J.M., J. Chromatogr., 575, 153 (1992).
• 20. Gratzfeld-Husgen A. and Schuster R., HPLC for environmental analysis, Hewlett-Packard Company, Printed in France, 1994, p. 28.
• 21. Michalowski T., Acta Protozool., 29, 47 (1990).
• 22. Czerkawski J.W., J. Sci. Fd. Agric., 27, 621 (1976).
• 23. Philipczyk J., Sudekum K.-H., Ahrens F. and Stangassinger M., J. Anim. Physiol. a. Nutr., 75, 105 (1996).
• 24. Robinson P.H., Fadel J.G. and Ivan M., Can. J. Anim. Sci., 76, 587 (1996).