Measurement of nitrate reductase activity in a field conditions – methodology

• Autorzy: Krywult M , Bielec D

Warianty tytułu

PL

Pomiar aktywności reduktazy azotanowej w warunkach terenowych – metodyka

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

During recent three decades interest for biomonitoring and ecological studies was rapidly growing. Therefore was necessary develop of new methods of analysis biochemical parameters whose allow quantify biological response of investigated organisms for environmental factors. The main goal of this paper demonstrates optimal conditions for enzyme kinetics analysis conducted in the field in situ. Nitrate reductase activity is typically assayed in vivo by measuring nitrite production in tissue which has been vacuum infiltrated with buffered nitrate solution. For this study a nitrate reductase assay was adapted from a number of studies with own modifications of authors. Leaves of examined plants were collected on investigated plots and immediately placed into test tubes with buffer solution (potassium phosphate dibasic containing 0.6% propanol-1) and evacuated in 0.33 atm. for 10 minutes. Then known amount of potassium nitrate was added, and the solution sample was analyzed in order to obtain a background level of nitrite. The foliage samples were incubated for 2 hours at 20 °C in darkness. Follow this procedure have given the most optimal conditions for reaction stability. After incubation the amount of synthesized nitrite was determined colorimetrically using sulfanilamide and N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, measured at 540 nm. The foliage samples were oven-dried to obtain their dry mass. Level of nitrate reductase activity was calculated as the amount of nitrite produced in nmol per gram of dry mass of foliage tissue per hour. The result obtained during these research demonstrate the changes of nitrate reductase dynamics according to change of incubation parameters. Dynamics of enzyme activity with changes of solution pH and incubation temperature was presented. Installation for conducting infiltration process and construction of incubation chamber is also described in this paper.

PL

W ciągu ostatnich trzech dekad zainteresowanie biomonitoringiem i badaniami ekologicznymi szybko wzrastało. Dlatego zaistniała konieczność rozwoju nowych metod analiz parametrów biochemicznych, które pozwoliłyby określić biologiczna odpowiedź badanych organizmów na działanie czynników środowiskowych. Głównym celem artykułu jest przedstawienie optymalnych warunków dla analiz kinetyki reakcji enzymatycznych przeprowadzonych w warunkach terenowych. Aktywność reduktazy azotanowej jest zwykle badane in vivo poprzez pomiar produkcji azotynów w tkankach roślinnych, które zostały poddane infiltracji w buforowanym roztworze azotanów. Metodykę oparto o liczne opracowania badawcze oraz wprowadzone własne modyfikacje. Liście dębu zbierano na badanej powierzchni, natychmiast umieszczano w probówkach z roztworem buforowym (fosforan potasu z dodatkiem 0,6% propanolu-1) i poddawano działaniu podciśnienia 0,33 atm. przez 10 min. Następnie dodano znaną ilość azotanu potasu, po czym próbkę roztworu oznaczano dla określenia zerowego stężenia azotynów. Próbki liści inkubowano przez 2 godziny w 20 °C w ciemności. W ten sposób uzyskano warunki stabilności reakcji. Po zakończeniu inkubacji stężenie zsyntezowanego azotynu określono kolorymetrycznie przy użyciu sulfanidamidu oraz N-(1-naftylo)etylenodwuaminy x 2HCl przy długości fali 540 nm. Próbki liści suszono do uzyskania suchej masy. Poziom aktywności reduktazy azotanowej obliczono jako ilość zsyntezowanego azotynu [nmol] na gram suchej masy na godzinę. Uzyskane wyniki wskazują dynamikę zmian aktywności reduktazy odpowiednio do zmian warunków inkubacji. Przedstawiono dynamikę zmian aktywności enzymu w zależności od pH buforu i temperatury inkubacji. Zaprezentowano również instalację dla przeprowadzenia procesu infiltracji i inkubacji liści.

Słowa kluczowe

EN

nitrate reductase; kinetic changes; field analysis methodology; optimization

PL

reduktaza azotanowa; kinetyka reakcji; metodyka analiz terenowych; optymalizacja reakcji

• Wydawca: Polskie Towarzystwo Inżynierii Ekologicznej
• Czasopismo: Inżynieria Ekologiczna
• Rocznik: 2013
• Tom: Nr 32
• Strony: 115--121
• Opis fizyczny: Bibliogr. 16 poz., tab., rys.

Twórcy

autor

Krywult M

• Institute of Engineering and Environmental Sciences, Faculty of Materials and Environmental Sciences, University of Bielsko-Biala, 43-309 Bielsko-Biala, ul. Willowa 2

autor

Bielec D

• Institute of Engineering and Environmental Sciences, Faculty of Materials and Environmental Sciences, University of Bielsko-Biala, 43-309 Bielsko-Biala, ul. Willowa 2

Bibliografia

• 1. Al Gharbi Q.A., Hipkin C.R. 1984. Studies on nitrate reductase on British angiosperms. New Phytologist, 97: 629-639.
• 2. Downs M.R., Nadelhoffer K.J., Melillo J.M., Aber J.D. 1993. Foliar and fine root nitrate reductase activity in seedlings of four forest tree species in relation to nitrogen availability. Trees, 7: 233-236.
• 3. Jaworski E.G. 1971. Nitrate reductase assay in intact plant tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications, 43: 1274-1279.
• 4. Keeney D.R., Nelson D.W. 1982. Nitrogen - inorganic forms. [in:] Methods of soil analysis, Part 2. Chemical and biological properties. Ed. A.L. Page. Agronomy, 9, 2: 643-698.
• 5. Krywult M., Bytnerowicz A. 1997. Induction of nitrate reductase activity by nitric acid vapor in California black oak (Quercus kelloggii), canyon live oak (Quercus chrysolepis), and Ponderosa pine (Ponderosa pine) seedlings. Canadian Journal of Forest Research, 27: 2101-2104.
• 6. Krywult M., Klich M. 2000. Nitrate reductase activity as an indicator of nitrate fixation and assimilation by tropical forest species on St. Thomas Island. Fragmenta Floristica et Geobotanica, 45, 1-2: 213-220.
• 7. Krywult M., Karolak A., Bytnerowicz A. 1996. Nitrate reductase activity as an indicator of Ponderosa pine (Pinus ponderosa Dougl. ex. Laws) response to atmospheric nitrogen deposition in the San Bernardino Mountains. Environmental Pollution, 93, 2: 141-146.
• 8. Krywult M., Turunen M., Sutinen M.-L., Derome K., Norokorpi Y. 2002. Nitrate reductase activity in some subarctic species and UV in influence in the foliage of Betula pendula Roth. seedlings. The Science of The Total Environment, 284, 1-3: 149-153.
• 9. Kumar A., Kumar H.D. 1988. Nitrogen-fixation by blue-green algae. [in]: Proceedings of the Plant Physiology Research, 1st International Congress of Plant Physiology. Ed. S.P. Sen. Society for Plant Physiology and Biochemistry, New Delhi, India: 85-103.
• 10. Mälkönen E. 1990. Estimation of nitrogen saturation on the basis of long-term fertilization experiments. Plant and Soil, 128: 75–82.
• 11. Nilsson L.O., Wiklund K. 1995. Nutrient balance and P, K, Ca, Mg, S and B accumulation in a Norway spruce stand following ammonium sulphate application, fertigation, irrigation, drought and N-free fertilisation. Plant and Soil, 168-169: 437-446.
• 12. Norby R.J. 1989. Foliar nitrate reductase: a marker for assimilation of atmospheric nitrogen oxides. [in:] Biologic markers of air – pollution stress and damage in forests. National Academy Press, Washington D.C: 245- 250.
• 13. Norby R.J., Weerasurija Y., Hanson P.J. 1989. Induction of nitrate reductase activity in red spruce needles by NO2 and HNO3 vapor. Canadian Journal of Forest Research, 19: 889-896.
• 14. Pérez-Soba M., van der Eerden L.J.M. 1993. Nitrogen uptake in needles of Scots pine (Pinus sylvestris L.) when exposed to gaseous ammonia and ammonium fertilizer in the soil. Plant and Soil, 153: 231–242.
• 15. Sinha R.P., Kumar A. 1992. Screening of blue-green algae for biofertilizer. [in:] Proceedings of the National Seminar on Organic Farming. Ed. P.S. Patil. Pune, India: 95–97.
• 16. Wingsle G., Näsholm T., Lundmark T., Ericsson A. 1987. Induction of nitrate reductase in needles of Scots pine seedlings by NOx and NO3. Physiologia Plantarum, 70: 399–403.